CAML Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403690-ACT

CAMLG codifica il ligando della ciclofilina modulatore del calcio (CAML), una proteina integrale di membrana del reticolo endoplasmatico che collega la segnalazione intracellulare del Ca²⁺ alla biogenesi delle proteine di membrana e ai programmi di sopravvivenza cellulare. CAML partecipa ai processi di ingresso del calcio mediati dal recettore e dipendenti dallo svuotamento dei depositi (store-operated) ed è stata collegata alla regolazione dell’attivazione dei linfociti, al controllo dell’apoptosi e alla proteostasi tramite vie associate al reticolo endoplasmatico. Influenzando risposte trascrizionali calcio-dipendenti e segnali di stress, CAML può modulare la proliferazione e la funzione delle cellule immunitarie. La deregolazione dell’espressione di CAMLG o della gestione del calcio mediata da CAML è stata associata, in modelli sperimentali, ad alterazioni della segnalazione di sopravvivenza e a fenotipi oncogenici, a supporto della sua rilevanza per studi meccanicistici in oncologia e immunobiologia.

CAML Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CAMLG senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

CAML Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CAMLG nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CAMLG, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di CAML. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CAMLG nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da CAML nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via CAML nelle cellule tumorali con espressione di CAMLG silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.