Plasmide CRISPR d'Activation (m) calsequestrin 1: sc-419471-ACT

Le gène murin *Casq1* code la calséquestrine 1, une protéine luminale du réticulum sarcoplasmique à forte capacité de liaison au Ca²⁺, qui tamponne le Ca²⁺ et contribue à façonner le couplage excitation–contraction dans les muscles squelettiques à contraction rapide. En orchestrant le stockage et la libération du Ca²⁺ de concert avec la signalisation du récepteur à la ryanodine et la machinerie du réticulum sarcoplasmique impliquée dans la gestion des ions, CASQ1 participe à l’homéostasie calcique, aux performances contractiles et à l’adaptation dépendante de l’activité. Des altérations de la fonction ou de l’expression de CASQ1 sont associées à une dérégulation de la dynamique intracellulaire du Ca²⁺, à une susceptibilité accrue aux lésions des fibres musculaires induites par le stress, ainsi qu’à des phénotypes de physiologie musculaire pertinents pour l’étude des myopathies et de réponses de type hyperthermie maligne. *Casq1* constitue donc un levier utile pour étudier, dans des modèles murins et des systèmes cellulaires ingénierés, le tamponnement du Ca²⁺ par le réticulum sarcoplasmique, la signalisation dépendante du Ca²⁺ et les mécanismes des maladies du muscle squelettique.

calsequestrin 1 Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Casq1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

calsequestrin 1 Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Casq1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Casq1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de calsequestrin 1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Casq1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de calsequestrin 1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie calsequestrin 1 dans les cellules tumorales présentant une expression de Casq1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.