CAF-1 p60 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-405091-ACT

CHAF1B codifica a subunidade p60 do fator 1 de montagem de cromatina (CAF-1), uma chaperona de histonas que deposita H3–H4 no DNA recém-sintetizado durante a montagem de nucleossomos acoplada à replicação. Por meio da coordenação com a PCNA nas forquilhas de replicação e durante o reparo por excisão de nucleotídeos, o CAF-1 favorece o restabelecimento da cromatina, a herança epigenética e a estabilidade do genoma após a síntese e o dano ao DNA. A desregulação da maturação da cromatina controlada por CHAF1B pode alterar as respostas ao estresse replicativo, a fidelidade do reparo do DNA e programas transcricionais ligados à proliferação e à diferenciação. A atividade aberrante do CAF-1 tem sido associada à desregulação do controle do ciclo celular e de vias de manutenção do genoma relevantes para a biologia do câncer e outros distúrbios caracterizados por instabilidade da cromatina.

CAF-1 p60 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de CHAF1B sem alterar a sequência de ADN subjacente.

CAF-1 p60 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus CHAF1B em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição CHAF1B, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de CAF-1 p60. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus CHAF1B nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de CAF-1 p60 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via CAF-1 p60 em células tumorais com expressão de CHAF1B silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.