BORIS CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403313-ACT

CTCFL kodiert BORIS („Brother of the Regulator of Imprinted Sites“), ein cancer-testis-DNA-bindendes Protein, das mit CTCF verwandt ist, insulator-ähnliche Sequenzen erkennt und die Chromatinarchitektur neu formt. BORIS ist an der epigenetischen Regulation der Transkription beteiligt, indem es die Promotor-/Enhancer-Aktivität, DNA-Methylierungszustände und die höhergeordnete Genomorganisation moduliert, und beeinflusst dadurch Prozesse wie die Expression von Keimbahn-Genen, Zellschicksalsprogramme und die Chromatinzugänglichkeit. Eine aberrante BORIS-Expression wird mit transkriptioneller Reprogrammierung sowie einer fehlregulierten Expression normalerweise stillgelegter Keimbahn- und onkogener Netzwerke in Verbindung gebracht, was BORIS zu einem nützlichen Ziel für die Untersuchung epigenetischer Plastizität und von Mechanismen der transkriptionellen Kontrolle in menschlichen Zellen macht.

BORIS Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CTCFL-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

BORIS Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CTCFL-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CTCFL-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen BORIS-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CTCFL-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von BORIS-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des BORIS-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CTCFL-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.