Plasmide CRISPR d'Activation (h) ALR: sc-403367-ACT

Le gène humain **GFER** code l’augmentateur de la régénération hépatique (**ALR**), une sulfhydryl oxydase dépendante du **FAD**, principalement localisée dans l’espace intermembranaire mitochondrial, où elle soutient le repliement oxydatif des protéines via le relais d’import mitochondrial **MIA40/CHCHD4**. En régulant la formation des ponts disulfure et l’homéostasie rédox, ALR contribue à la biogenèse mitochondriale, au fonctionnement de la chaîne respiratoire et aux réponses cellulaires au stress. Des perturbations de **GFER** ont été associées à des phénotypes de dysfonction mitochondriale et à des troubles multisystémiques touchant des tissus à forte demande énergétique, ce qui en fait une cible pertinente pour l’étude de la signalisation régulée par le rédox, de la protéostasie et du contrôle qualité des organites.

ALR Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de GFER sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

ALR Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus GFER dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription GFER, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de ALR. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus GFER natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de ALR au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie ALR dans les cellules tumorales présentant une expression de GFER silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.