20 µg de plásmido de ADN purificado listo para la trasfección; suficiente para 20 transfecciones máximo
AKAP 12 El plásmido CRISPR/Cas9 Knockout (KO) (h) es un conjunto de plásmidos, cada uno de los cuales codifica la nucleasa Cas9 y un ARN guía (gRNA) de 20 nt específico para el objetivo, diseñado para lograr la máxima eficiencia de knockout utilizando secuencias derivadas de la biblioteca GeCKO v2
Las secuencias de gRNA dirigen a Cas9 para que induzca roturas de doble cadena (DSB) específicas en el locus genómico AKAP 12, lo que da lugar a la inactivación del gen mediante unión de extremos no homólogos (NHEJ)
Se recomienda el plásmido HDR AKAP 12 (h) (sc-406008-HDR) para la cotransfección con el plásmido CRISPR/Cas9 KO AKAP 12 (h) a fin de permitir la selección de células editadas con éxito mediante la integración mediada por HDR de un casete de resistencia a la puromicina y un gen reportero RFP
El plásmido HDR AKAP 12 (h) es un conjunto de plásmidos, cada uno de los cuales contiene una plantilla de reparación dirigida por homología (HDR) correspondiente a los sitios diana del ARN guía (gRNA) en el plásmido CRISPR/Cas9 KO AKAP 12 (h)
Cada plásmido HDR contiene dos brazos de homología de ~800 pb que flanquean los casetes de resistencia a la puromicina y RFP, diseñados para unirse a secuencias de ADN genómico que rodean el sitio de rotura de doble cadena inducida por Cas9 y facilitar la integración precisa mediada por HDR
Los genes de resistencia a la puromicina y RFP están flanqueados por sitios LoxP, lo que permite la eliminación de los marcadores de selección mediante la recombinasa Cre (Vector Cre: sc-418923) tras el establecimiento de líneas celulares knockout estables
Tras la transfección, la eficacia del knockout puede comprobarse mediante WB, IF ó IHC utilzando el anticuerpo: AKAP 12 Anticuerpo (C-12): sc-376740