Plásmido CRISPR de Activación (h) AFX1: sc-402408-ACT

El FOXO4 humano codifica el factor de transcripción forkhead box O AFX1, un regulador sensible al estrés que integra la señalización de insulina/IGF-1–PI3K–AKT con programas que controlan la detención del ciclo celular, la resistencia al estrés oxidativo, el metabolismo y la apoptosis. La actividad de AFX1 se modula mediante un transporte nuclear–citoplasmático dependiente de la fosforilación y por el diálogo cruzado con las vías MAPK y JNK, configurando salidas transcripcionales vinculadas a la homeostasis celular. A través de la regulación de genes diana implicados en las respuestas al daño del ADN y el equilibrio redox, FOXO4 contribuye a fenotipos asociados a la senescencia y a procesos de envejecimiento tisular. La señalización desregulada de FOXO4/AFX1 se ha asociado con la remodelación de vías oncogénicas y con una tolerancia al estrés alterada en múltiples contextos patológicos, lo que lo convierte en un nodo útil para estudios mecanísticos del control transcripcional.

AFX1 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de FOXO4 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

AFX1 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus FOXO4 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional FOXO4, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de AFX1. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo FOXO4 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de AFX1 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía AFX1 en células tumorales con expresión de FOXO4 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.