ADSL Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-404936-ACT

A ADSL humana codifica a adenilsuccinato liase, uma enzima bifuncional da biossíntese de novo de purinas que catalisa a clivagem do adenilsuccinato em AMP e fumarato e a conversão de SAICAR em AICAR. Por meio dessas reações, a ADSL sustenta a homeostase de nucleotídeos e conecta o metabolismo de purinas ao metabolismo central do carbono via produção de fumarato, influenciando a proliferação celular e o equilíbrio energético. Alterações na atividade da ADSL desorganizam os estoques de nucleotídeos de purina e podem modificar a sinalização metabólica associada ao controle do crescimento. Variantes em ADSL estão associadas à deficiência de adenilsuccinato liase, um distúrbio metabólico caracterizado pelo acúmulo de succinilpurinas, com efeitos subsequentes no neurodesenvolvimento e na fisiologia sistêmica.

ADSL O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de ADSL sem alterar a sequência de ADN subjacente.

ADSL O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus ADSL em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição ADSL, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de ADSL. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus ADSL nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de ADSL no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via ADSL em células tumorais com expressão de ADSL silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.