Adipsin CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401782-ACT

Komplementfaktor D (CFD), auch als Adipsin bekannt, ist eine sezernierte Serinprotease, die als geschwindigkeitsbestimmendes Enzym des alternativen Komplementwegs fungiert, indem sie den an C3b gebundenen Faktor B spaltet und so die C3-Konvertase (C3bBb) erzeugt. Neben der Amplifikation der angeborenen Immunantwort und der Opsonisierung wird menschliches Adipsin in hohem Maße von Adipozyten exprimiert und verknüpft den metabolischen Zustand mit entzündlicher Signalgebung innerhalb der Mikroumgebung des Fettgewebes. Die CFD-Aktivität beeinflusst komplementabhängige Zytokinprogramme, die Rekrutierung von Immunzellen und lokale Gewebeumbauprozesse über nachgeschaltete C3a/C5a-Anaphylatoxin-Signale. Eine fehlregulierte Komplementaktivierung und veränderte CFD-Expression wurden mit entzündlichen und metabolischen Phänotypen in Verbindung gebracht, darunter Fettgewebsdysfunktion sowie breitere Kontexte immunvermittelter Erkrankungen.

Adipsin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CFD-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Adipsin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CFD-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CFD-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Adipsin-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CFD-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Adipsin-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Adipsin-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CFD-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.