ACTA1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400005-ACT

ACTA1 kodiert das α-Aktin der Skelettmuskulatur, einen zentralen Bestandteil der dünnen Filamente, der zu F‑Aktin polymerisiert und so die Sarcomerassemblierung, die Kraftentwicklung und die Organisation des Zytoskeletts in quergestreifter Muskulatur unterstützt. Durch Interaktionen mit Myosin, Tropomyosin und dem Troponin-Komplex ist ACTA1 in die Aktomyosin-Kontraktilität und Mechanotransduktionsprozesse eingebunden, die Struktur und Funktion von Muskelfasern prägen. ACTA1-abhängige Aktindynamiken beeinflussen zudem die Zellarchitektur und Signalwege, die mit der Muskel-Differenzierung und -Erhaltung verknüpft sind. Eine Fehlregulation oder pathogene Variation in ACTA1 ist mit erblichen Skelettmyopathien assoziiert, die durch eine gestörte Filamentorganisation und eine veränderte kontraktile Leistungsfähigkeit gekennzeichnet sind.

ACTA1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ACTA1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

ACTA1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ACTA1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ACTA1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen ACTA1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ACTA1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von ACTA1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des ACTA1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ACTA1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.