Plásmido CRISPR de Activación (h) ACOT8: sc-407262-ACT

El ACOT8 humano codifica una tioesterasa peroxisomal de acil‑coenzima A que hidroliza ésteres de acil‑CoA para generar ácidos grasos libres y CoA, lo que ayuda a equilibrar los reservorios de acil‑CoA y a mantener la disponibilidad de CoA. Al regular el manejo lipídico peroxisomal, ACOT8 influye en la β‑oxidación de ácidos grasos, la remodelación de lípidos y la homeostasis redox asociada al metabolismo peroxisomal productor de peróxido de hidrógeno. La actividad de ACOT8 se integra con programas metabólicos más amplios que coordinan la comunicación entre peroxisomas y mitocondrias y las respuestas celulares al estrés nutricional y oxidativo. Las alteraciones del metabolismo lipídico peroxisomal y de la homeostasis de CoA son relevantes para la disfunción metabólica y la biología de enfermedades asociadas a los peroxisomas, lo que respalda el uso de ACOT8 como diana en estudios de fenotipos celulares impulsados por lípidos.

ACOT8 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de ACOT8 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

ACOT8 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus ACOT8 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional ACOT8, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de ACOT8. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo ACOT8 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de ACOT8 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía ACOT8 en células tumorales con expresión de ACOT8 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.