AATM CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403969-ACT

Das humane GOT2 kodiert die mitochondriale Aspartat-Aminotransferase (AATM), ein pyridoxalphosphatabhängiges Enzym, das die reversible Transaminierung zwischen Glutamat/Oxalacetat und Aspartat/α‑Ketoglutarat katalysiert. AATM ist ein zentraler Bestandteil des Malat‑Aspartat‑Shuttles, der das zytosolische und mitochondriale Redoxgleichgewicht koppelt, indem er reduzierende Äquivalente in die Mitochondrien überträgt und die NADH/NAD⁺‑Homöostase unterstützt. Über seine Funktionen im Aminosäurestoffwechsel, bei der Anaplerose des TCA‑Zyklus und im Stickstoffhaushalt beeinflusst GOT2 die mitochondriale Bioenergetik sowie die Aspartatverfügbarkeit, die für die Nukleotidsynthese erforderlich ist. Eine Dysregulation GOT2‑assoziierter Signal- und Stoffwechselwege wurde mit veränderten Stoffwechselzuständen in proliferierenden und stressadaptierten Zellen in Verbindung gebracht, was GOT2 für Studien zur metabolischen Umprogrammierung und zur mitochondrialen Funktion relevant macht.

AATM Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen GOT2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

AATM Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des GOT2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der GOT2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen AATM-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native GOT2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von AATM-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des AATM-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem GOT2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.