α-tectorin CRISPR Activation Plasmid (h): sc-405876-ACT

TECTA kodiert α-Tektorin, ein wichtiges nicht-kollagene(s) Glykoprotein der tectorialen Membran des Innenohrs, das zur Organisation der Architektur der extrazellulären Matrix beiträgt, die für eine effiziente mechanoelektrische Transduktion durch die Haarzellen der Cochlea erforderlich ist. Durch seine Funktionen bei der Matrixassemblierung und der strukturellen Kopplung zwischen der tectorialen Membran und den Stereozilien unterstützt α-Tektorin schallinduzierte Scherkräfte und die Frequenzabstimmung. Eine Störung von TECTA kann die Integrität der tectorialen Membran beeinträchtigen und die Hörfunktion verändern, wodurch es ein Schlüsselgen für die Untersuchung der Biologie sensorischer extrazellulärer Matrizen ist. Varianten in TECTA sind mit erblichen Formen der Hörminderung assoziiert und verknüpfen die Funktion von α-Tektorin mit krankheitsrelevanten Phänotypen in auditiven Forschungsmodellen.

α-tectorin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TECTA-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

α-tectorin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TECTA-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TECTA-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen α-tectorin-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TECTA-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von α-tectorin-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des α-tectorin-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TECTA-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.