α1b Tubulin Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400021-ACT

TUBA1B codifica l’α1b-tubulina umana, una principale isoforma di α-tubulina che eterodimerizza con la β-tubulina per formare i microtubuli, fornendo un supporto strutturale essenziale per il trasporto intracellulare, la polarità cellulare e l’assemblaggio del fuso mitotico. Il rimodellamento dinamico dei microtubuli regola processi quali il traffico vescicolare, la ciliogenesi e la segregazione dei cromosomi, attraverso una regolazione coordinata da parte delle proteine associate ai microtubuli e delle modificazioni post-traduzionali della tubulina. L’alterazione dell’omeostasi della tubulina può modificare l’organizzazione del citoscheletro, la progressione del ciclo cellulare e le risposte allo stress, collegando la biologia della tubulina alla segnalazione proliferativa e all’adattamento cellulare. In quanto componente citoscheletrica ampiamente espressa, l’α1b-tubulina è spesso utilizzata per studiare la dinamica dei microtubuli e i fenotipi dipendenti dal citoscheletro rilevanti per il comportamento delle cellule tumorali e per la biologia dello sviluppo neurobiologico.

α1b Tubulin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di TUBA1B senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

α1b Tubulin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus TUBA1B nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione TUBA1B, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di α1b Tubulin. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus TUBA1B nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da α1b Tubulin nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via α1b Tubulin nelle cellule tumorali con espressione di TUBA1B silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.