α1A-AR CRISPR/Cas9 KO Plasmid (m2): sc-419021-KO-2

Übersicht

Adra1a kodiert den murinen α1A‑adrenergen Rezeptor (α1A‑AR), einen G‑Protein‑gekoppelten Rezeptor, der überwiegend über Gq/11 signalisiert und dadurch die Phospholipase C, die Inositolphosphat‑Bildung, die Mobilisierung von intrazellulärem Ca2+ sowie PKC‑abhängige Phosphorylierungskaskaden aktiviert. Die Aktivierung des α1A‑AR greift zudem in MAPK/ERK‑Signalwege und in ein RhoA‑vermitteltes Remodeling des Zytoskeletts ein und beeinflusst so – je nach Gewebe und Kontext – die Kontraktilität glatter Muskulatur und die neuronale Erregbarkeit. Dieser Rezeptor trägt zur sympathischen Regulation des Gefäßtonus und der Funktion des unteren Harntrakts bei und wird in Modellen der kardiovaskulären Physiologie, der Neurobiologie und des organspezifischen Remodelings untersucht. Eine dysregulierte adrenerge Signalübertragung wird in der präklinischen Forschung häufig genutzt, um Mechanismen zugrunde liegender hypertonieassoziierter Gefäßreaktionen, stressbezogener neuronaler Schaltkreise und urogenitaler Hyperreaktivität der glatten Muskulatur zu untersuchen.

α1A-AR CRISPR/Cas9-KO-Plasmid (m2) ist ein Pool von Plasmiden, die für die gezielte Disruption des Adra1a-Gens in mouse-Zelllinien entwickelt wurden. Jedes Plasmid im Pool koexprimiert eine einzigartige sgRNA, die auf eine bestimmte Stelle innerhalb des Adra1a-Lokus abzielt, zusammen mit der Streptococcus pyogenes Cas9-Nuklease, und kodiert für GFP, um die fluoreszente Identifizierung und Anreicherung erfolgreich transfizierter Zellen zu ermöglichen. Diese Multi-Guide-Strategie erhöht die Wahrscheinlichkeit, Frameshifts oder Deletionen zu induzieren, die zu einem funktionellen Knockout führen, und bietet damit eine robustere Alternative zu Single-Guide-Ansätzen. An mehreren Stellen induzierte DSBs werden durch nicht-homologe Endverknüpfung (NHEJ) oder, bei Verwendung mit der enthaltenen HDR-Donor-Matrize, durch homologe Reparatur (HDR) an einer definierten Zielstelle innerhalb des Lokus repariert.

Bei Verwendung in Verbindung mit dem RFP-exprimierenden HDR-Donor können GFP- und RFP-Fluoreszenz gemeinsam genutzt werden, um transfizierte von editierten Zellpopulationen zu unterscheiden, was die auf Durchflusszytometrie basierenden Sortier- und Klonauswahl-Workflows optimiert.

Homology-Directed Repair (HDR)-Donor — Puromycin-Kassette mit RFP-Reporter

Für Anwendungen, die bestätigte, selektierbare Knockout-Klone erfordern, enthält das α1A-AR HDR-Plasmid (m2) ein HDR-Donorkonstrukt mit einer Puromycin-Resistenzkassette (PuroR) und einem Reporter für rotes fluoreszierendes Protein (RFP), flankiert von Homologiearmen, die für eine definierte Adra1a Zielstelle spezifisch sind.
Bei Co-Transfektion mit dem α1A-AR CRISPR/Cas9-KO-Plasmid (m2):

• Die PuroR-RFP-Kassette integriert sich über HDR an der Cas9-Schnittstelle und unterbricht dabei das Adra1a offene Lesegerüst.
  Die RFP-Fluoreszenz liefert einen unmittelbaren visuellen Hinweis auf eine erfolgreiche Integration und ermöglicht die fluoreszenzbasierte Identifizierung oder Sortierung editierter Zellen vor oder parallel zur Puromycin-Selektion.
  Erfolgreich editierte Zellen werden durch Puromycin-Resistenz bestätigt, was den Aufwand für das Klon-Screening erheblich reduziert.
  Diese Selektionsstrategie eignet sich ideal zur Erzeugung stabiler, klonaler KO-Zelllinien für nachgelagerte Funktionsstudien, Wirkstoffscreenings oder die Modellentwicklung.

Cre-lox-Kassetten-Entfernungssystem

Das HDR-Donorkonstrukt verfügt über loxP-Stellen, die die PuroR-RFP-Selektionskassette flankieren, um eine saubere Markerentfernung nach der Klonbestätigung zu ermöglichen. Die transiente Expression der Cre-Rekombinase über das enthaltene Cre-Vektor: sc-418923 schneidet die Kassette heraus, wobei eine minimale Rest-loxP-Stelle innerhalb des Adra1a-Lokus verbleibt und potenzielle Störeffekte auf nachgeschaltete Assays eliminiert werden.
Dieser zweistufige Ansatz:

• Minimiert Störungen der lokalen Chromatinarchitektur und benachbarter regulatorischer Elemente
  Stellt einen nahezu nativen genomischen Kontext am editierten Locus wieder her
  Ermöglicht die Wiederverwendung der Puromycin-Selektionsstrategie in derselben Zelllinie für weitere Editierungen

Hauptmerkmale

• gRNA, die auf Adra1a Exon(e) abzielt, die für die α1A-AR Funktion entscheidend sind
  Koexpression von SpCas9 und sgRNA aus einem einzigen Plasmid für eine vereinfachte Verabreichung
  HDR-Donor mit Puromycin-Resistenz für die positive Klonselektion
  loxP-flankierte PuroR-Kassette mit Cre-Rekombinase-Vektor für die nahtlose Markerentfernung
  Wird gebrauchsfertig für die Verabreichung durch Transfektion geliefert

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.