Plasmide CRISPR d'Activation (h) TFIIH p62: sc-402239-ACT

GTF2H1 code la sous-unité p62 de TFIIH, un composant central du complexe TFIIH qui coordonne l’initiation de la transcription par l’ARN polymérase II avec la réparation par excision de nucléotides (NER). TFIIH assure l’ouverture du promoteur, la sélection du site de démarrage de la transcription et la reconnaissance/réparation des lésions de l’ADN grâce à ses interactions avec les autres sous-unités de TFIIH et des facteurs de réparation, reliant ainsi la transcription basale au maintien du génome. Une altération de la fonction de TFIIH et des défauts de NER sont associés à une sensibilité aux UV et à des syndromes de réparation couplée à la transcription, soulignant l’importance de p62 dans les réponses cellulaires au stress génotoxique. En tant que facteur de type échafaudage au sein de TFIIH, p62 constitue un point d’entrée pertinent pour analyser les interactions entre la régulation transcriptionnelle et les voies de réparation de l’ADN.

TFIIH p62 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de GTF2H1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

TFIIH p62 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus GTF2H1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription GTF2H1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de TFIIH p62. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus GTF2H1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de TFIIH p62 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie TFIIH p62 dans les cellules tumorales présentant une expression de GTF2H1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.