Plásmido CRISPR de Activación (h) KCNMB4: sc-405044-ACT

KCNMB4 codifica la subunidad auxiliar β4 de los canales de potasio de gran conductancia (BK), activados por calcio y voltaje, modulando la cinética de compuerta del canal, la sensibilidad al calcio y la excitabilidad de la membrana. En neuronas humanas y otros tejidos excitables, KCNMB4 ayuda a ajustar el disparo de potenciales de acción y la repolarización dependiente de Ca2+, integrándose con la señalización de Ca2+ y la homeostasis electrofisiológica. Al moldear el comportamiento de los canales BK, influye en procesos como la neurotransmisión, la adaptación de la frecuencia de disparo y las vías de señalización dependientes de la actividad vinculadas a la regulación de canales iónicos. La desregulación de la composición de los canales BK, incluida la alteración de la expresión de subunidades β, se ha implicado en fenotipos neurológicos en los que se altera el equilibrio de la excitabilidad, lo que respalda su utilidad en estudios mecanísticos de canalopatías y del estrés celular impulsado por la excitabilidad.

KCNMB4 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de KCNMB4 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

KCNMB4 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus KCNMB4 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional KCNMB4, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de KCNMB4. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo KCNMB4 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de KCNMB4 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía KCNMB4 en células tumorales con expresión de KCNMB4 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.