ferritin heavy chain Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-418152-ACT

FTH1 codifica la catena pesante della ferritina, una subunità ferroxidasica del complesso della ferritina che converte Fe2+ in Fe3+ e consente l’immagazzinamento del ferro, limitando così il ferro labile e il danno ossidativo catalizzato dal ferro. Tamponando il ferro intracellulare, FTH1 influenza l’omeostasi redox, il metabolismo mitocondriale e la rete elemento responsivo al ferro/proteina regolatrice del ferro (IRE/IRP), che coordina assorbimento, utilizzo e stoccaggio del ferro. La catena pesante della ferritina interagisce inoltre con i programmi di risposta allo stress e con vie di morte cellulare dipendenti dal ferro, come la ferroptosi, attraverso il controllo della disponibilità di ferro. Un’espressione deregolata di FTH1 o un’alterazione della funzione della ferritina è associata a risposte allo stress ossidativo modificate e a una cattiva gestione del ferro osservate in ambiti quali biologia del cancro, neurodegenerazione e condizioni infiammatorie.

ferritin heavy chain Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di FTH1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ferritin heavy chain Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus FTH1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione FTH1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ferritin heavy chain. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus FTH1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ferritin heavy chain nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ferritin heavy chain nelle cellule tumorali con espressione di FTH1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.