Plasmide CRISPR d'Activation (h) 14-3-3 θ: sc-401384-ACT

YWHAQ code la protéine adaptatrice humaine 14-3-3 thêta, membre de la famille 14-3-3, qui se lie à des motifs phosphosérine/phosphothréonine afin de moduler la localisation, la stabilité et l’activité de nombreuses protéines de signalisation. Grâce à ces interactions, 14-3-3 thêta contribue à coordonner le contrôle du cycle cellulaire, les réponses au stress et la signalisation apoptotique, en s’intégrant à des réseaux pilotés par des kinases tels que les voies MAPK/ERK, PI3K-AKT et des voies apparentées à RAF. Sa fonction d’échafaudage influence le trafic des protéines et la dynamique du cytosquelette, participant à la régulation des programmes transcriptionnels et de l’homéostasie métabolique. Des interactions 14-3-3 dérégulées ainsi qu’une expression altérée de YWHAQ ont été associées à des phénotypes pertinents en cancérologie et en neurobiologie, ce qui étaye son utilisation dans des études mécanistiques sur le remodelage des voies de signalisation et l’adaptation au stress cellulaire.

14-3-3 θ Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de YWHAQ sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

14-3-3 θ Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus YWHAQ dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription YWHAQ, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de 14-3-3 θ. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus YWHAQ natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de 14-3-3 θ au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie 14-3-3 θ dans les cellules tumorales présentant une expression de YWHAQ silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.