Sistemi CRISPR
Santa Cruz Biotechnology now offers target-specific CRISPR/Cas9 Knockout (KO) Plasmids, CRISPR Double Nickase Plasmids, CRISPR/ dCas9 Activation Plasmids and CRISPR Lenti Activation Systems for over 18,910 human and 18,340 mouse protein encoding genes.
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Storia di CRISPR/Cas9
Il sistema CRISPR/Cas è un meccanismo di difesa immuno-adattativo utilizzato da Archea e Bacteria per la degradazione di materiale genetico estraneo. In questi organismi, il materiale genetico esterno al batteriofago viene acquisito ed integrato nei loci CRISPR (1,2). Questo nuovo materiale, noto anche come spacer, crea un frammento sequenza-specifico utilizzato per la futura resistenza contro un infezione batteriofaga. Questi frammenti sequenza-specifici sono trasferiti in corti CRISPR RNAs (crRNAs) e fungono da guida per indirizzare il taglio del DNA complementare invasivo attraverso l'attività della nucleasi della proteina CRISPR-associata (Cas) anch'essa codificata dai loci CRISPR (1,2). La nucleasi Cas9 del sistema CRISPR di tipo II possiede un dominio di legame all'RNA, una sezione di riconoscimento dell'alpha elica (REC), una sezione nucleasi che include RuvC e HNH per il taglio del DNA, ed un motivo adiacente protospacer (PAM) che interagisce col sito (1,2). Il crRNA forma un complesso con la nucleasi Cas9 legandosi al ponte elica con la sezioneREC, e forma diversi ponti con la struttura del crRNA (1,2,3).
Una volta che il crRNA si lega al Cas9 la conformazione della nucleasi Cas9 cambia e crea un canale che permette il legame al DNA (1,2,3). Il complesso Cas9/crRNA ricerca sul DNA un sito PAM (5'-NGG) (4,5,6). Il riconoscimento del sito PAM guida alla distensione del DNA, e permette al crRNA di cercare DNA complementare adiacente al sito PAM. Quando Cas9 si lega al sito PAM adiacente alla sequenza di DNA che è complementare al crRNA, l'elica ponte con la sezione REC crea un eteroduplex RNA-DNA con il DNA target (3,4,7). Il riconoscimento del sito PAM è coinvolto nell'attivazione dei domini nucleolitici HNH e RuvC che creano un DSB (rottura double stranded) nel DNA target, portando alla degradazione del DNA (1,2,5,8). Se il crRNA non è complementare Cas9 si distacca e ricerca un altro sito PAM (7). Lo strand genomico target che si rompe nel DNA può essere riparato attraverso il pathway di riparazione per nonhomologous end-joining (NHEJ), che introduce inserzioni o delezioni generando errori, oppure attraverso il pathway di riparazione omologia-diretto (HDR), che può essere utilizzato per ricombinare i marker selezionati ai siti specifici nel genoma (2,9,10). Questo meccanismo CRISPR/Cas9 può essere riproposto come strumento di ingegneria genomica di diversi sistemi, cellule di mammifero incluse.
Il processamento del genoma attraverso l'introduzione di DSB può essere realizzato con meganucleasi, nucleari zinc-finger (ZF), o con effettori transattivatori (TALEs), che riconoscono le sequenze di DNA, comunque, ciascuno ha le sue limitazioni. Quando si utilizzano le meganucleasi è difficile mostrare chiaramente il riconoscimento sito-specifico tra la nucleari e il DNA (2). Le altre opzioni, ZFs e TALEs, hanno dimostrato difficoltà nel riconoscere fino a 3 nt di DNA (2). Singoli RNA guida (sgRNA) che agiscono come crRNAs sono facilmente progettabili e possono essere espressi al fianco della nucleari Cas9 nello stesso vettore diretto vesso specifici siti di DNA per il processamento del genoma. Il sistema CRISPR/Cas 9 presenta anche un'alta sensibilità ed è più efficiente dello small hairpin RNA nello screening.
Un vantaggio significativo dell'utilizzo del sistema CRISP/Cas9 per indurre un DSB nel DNA genomico è il suo alto livello di efficienza. Comunque, questa efficienza può essere offuscata da un certo numero di effetti off-target, riducendo quindi la specificità del processamento CRISPR/Cas9. La specificità pu`essere migliorata utilizzando il sistema CRISPR double nickase, in cui due plasmidi, ciascuno codificante un Cas9 (D10A) mutante nickase (Cas9n) sono diretti ad una distinta regione specifica nel DNA genomico dall'RNA guida target specifico (12). Ciascun complesso Cas9n/sgRNA crea solo un nich nello strand del DNA che è complementare al RNA guida. Ciascun paio di RNA guida sono offset di circa 20 paia di basi e riconoscono le sequenze target localizzate sulle eliche opposte del DNA target. Il doppio nick creato dai due complessi Cas9n/sgRNA mimano un DSB (12). Quindi, l'utilizzo di RNA guida appaiati permette di aumentare la specificità de processamento genico Cas9 mediato, mantenendo un alto livello di efficienza (12).
Oltre al processamento del genoma, il sistema CRISPR è stato ingegnerizzato per permettere una robusta attivazione dell'espressione genica endogena (12). Diverse componenti del sistema CRISPR sono state modificate per generare il complesso SAM (synergistic activation mediator) che risulta in un sistema di attivazione trascrizionale altamente efficiente e specifico (12). Un componente del complesso SAM modificato è la nucleasi Cas9. Nel sistema SAM, i domini catalitici di Cas9 sono stati disattivati e il dCas9 risultante è stato fuso con il dominio di attivazione trascrizione (VP64). Diretto da un RNA guida target specifico (sgRNA), il complesso dCas9-VP64-sgRNA si indirizza verso la regione di 200 bp dal Transcriptional Start Site (TSS) dei geni endogeni per upregolare l'espressione genica (12). Per una maggiore trascrizione, sgRNA è stato modificato aggiungendo una piccola forcina aptamero al tetraloop e allo stem loop 2 (12). Questo aptamero sul sgRNA lega selettivamente le proteine MS2 dimerizzate del capside del batteriofago (12). Fondendo le proteine MS2 ai domini di transattivazione p65 e HSF1 si ottiene la proteina di fusione risultante MS2-P65-HSF1 per migliorare il reclutamento dei fattori di trascrizione, in modo tale da aumentare la potenza di attivazione genica mediata da dCas9 (12). I prodotti di Attivazione sono forniti come plasmidi standard per la trasfezione e plasmidi lentivirali per l'impacchettamento lentivirale e la trasduzione, e per la consegna effcieinte del Sistema di attivazione trascrizionale SAM nei tipi cellulari (13).
Quick Links
Double Strand Break (DSB) diretto CRISPR/Cas9


