Plasmide CRISPR d'Activation (h) Tiam1: sc-400674-ACT

TIAM1 code pour Tiam1, un facteur d’échange de nucléotides guanyliques (GEF) spécifique de Rac1, qui relie les signaux en amont provenant des récepteurs et de l’adhérence au remodelage du cytosquelette d’actine, à la polarité cellulaire et à la migration dirigée. En activant Rac1 et en se coordonnant avec la signalisation des GTPases de la famille Rho, Tiam1 influence la formation de lamellipodes, la dynamique des jonctions d’adhérence et la plasticité épithélio-mésenchymateuse, en s’intégrant à des voies telles que la signalisation PI3K et l’adhérence médiée par les intégrines. Des programmes dépendants de TIAM1 ont été associés à un comportement invasif et à un potentiel métastatique dans de multiples contextes tumoraux, et une activité altérée de Tiam1 est également pertinente pour des processus de neurodéveloppement et le remodelage synaptique. Ces propriétés font de TIAM1 un nœud utile pour étudier la régulation du cytosquelette, la stabilité des contacts cellule–cellule et les réseaux de transduction du signal qui contrôlent la motilité.

Tiam1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de TIAM1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Tiam1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus TIAM1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription TIAM1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Tiam1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus TIAM1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Tiam1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Tiam1 dans les cellules tumorales présentant une expression de TIAM1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.