TBC1D7 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403595-ACT

TBC1D7 codifica uma pequena proteína contendo domínio TBC que atua como componente central do complexo TSC1–TSC2–TBC1D7, um importante regulador negativo da sinalização de mTORC1. Ao estabilizar o complexo TSC e sustentar a atividade de GAP em relação a RHEB, a TBC1D7 ajuda a integrar sinais de fatores de crescimento e de nutrientes ao controle da síntese proteica, da autofagia e do metabolismo celular. Alterações na dosagem ou na função de TBC1D7 têm sido associadas à desregulação da atividade da via mTOR e a fenótipos compatíveis com comprometimento de redes supressoras de tumor. Como resultado, TBC1D7 é amplamente estudada em contextos como controle do crescimento celular, respostas ao estresse e crosstalk entre vias que influencia proliferação e diferenciação.

TBC1D7 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de TBC1D7 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

TBC1D7 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus TBC1D7 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição TBC1D7, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de TBC1D7. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus TBC1D7 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de TBC1D7 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via TBC1D7 em células tumorais com expressão de TBC1D7 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.