rhodopsin Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401026-ACT

O gene humano RHO codifica a rodopsina, um recetor acoplado à proteína G sensível à luz, incorporado nos discos do segmento externo dos fotorrecetores do tipo bastonete, que inicia a cascata de fototransdução. Após a absorção de um fotão, a rodopsina ativa a transducina para modular a sinalização por cGMP, controlando a atividade dos canais regulados por nucleótidos cíclicos e a hiperpolarização subsequente da membrana, crítica para a visão em baixa luminosidade. A expressão de RHO e a renovação/turnover da proteína estão intimamente ligadas a processos de homeostase retiniana, incluindo a regeneração do cromóforo no ciclo visual, o tráfego para os segmentos externos e a desativação regulada de GPCR. A desregulação ou mutação de RHO está associada a degenerações hereditárias da retina, tornando-o um alvo-chave para estudos mecanísticos da sinalização de GPCR, das respostas ao stress dos fotorrecetores e da regulação génica em modelos retinianos.

rhodopsin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de RHO sem alterar a sequência de ADN subjacente.

rhodopsin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus RHO em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição RHO, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de rhodopsin. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus RHO nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de rhodopsin no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via rhodopsin em células tumorais com expressão de RHO silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.