Plasmide CRISPR d'Activation (h) Rab 33B: sc-404070-ACT

RAB33B code pour Rab33B, une petite GTPase de la famille Rab qui régule des événements de trafic membranaire liés à l’appareil de Golgi et à des compartiments associés à l’autophagie. En alternant entre les états liés au GDP et au GTP, Rab33B coordonne le bourgeonnement des vésicules, leur transport et leur arrimage/fusion afin de soutenir le tri du cargo et l’homéostasie des organites. Le trafic dépendant de RAB33B recoupe les voies de macroautophagie et le turnover intracellulaire des protéines, des processus souvent étudiés dans le contexte de la neurodégénérescence, de la biologie des infections et des réponses au stress des cellules cancéreuses. La perturbation ou la dérégulation des réseaux de transport médiés par les Rab peut affecter le flux de la voie sécrétoire et la dynamique autophagique, offrant des points d’entrée mécanistiques pour la recherche en biologie cellulaire liée aux maladies.

Rab 33B Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de RAB33B sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Rab 33B Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus RAB33B dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription RAB33B, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Rab 33B. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus RAB33B natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Rab 33B au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Rab 33B dans les cellules tumorales présentant une expression de RAB33B silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.