Plasmide CRISPR d'Activation (h2) NHE-6: sc-404829-ACT-2

Le gène humain SLC9A6 code l’échangeur endosomal Na⁺/H⁺ NHE-6, un transporteur membranaire qui régule le pH luminal et l’homéostasie ionique au sein des endosomes précoces et de recyclage. En contrôlant l’acidification endosomale, NHE-6 influence le trafic des récepteurs, le tri des cargos et les processus de transduction du signal couplés à l’endocytose et au transport vésiculaire, avec des effets en aval sur le développement neuronal et la fonction synaptique. La dérégulation de SLC9A6 ou des variants entraînant une perte de fonction sont associés à des phénotypes neurodéveloppementaux et neurodégénératifs, faisant de NHE-6 une cible pertinente pour l’étude de la dynamique du pH endosomal, des voies de trafic membranaire et des relations génotype–phénotype. L’édition génomique de SLC9A6 dans des modèles cellulaires humains permet d’interroger la signalisation dépendante des endosomes, le recyclage des protéines et les réponses au stress cellulaire liées à une altération de l’équilibre acido-basique des organites.

NHE-6 Le plasmide d'activation CRISPR (h2) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de SLC9A6 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

NHE-6 Le plasmide d'activation CRISPR (h2) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus SLC9A6 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription SLC9A6, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de NHE-6. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus SLC9A6 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de NHE-6 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie NHE-6 dans les cellules tumorales présentant une expression de SLC9A6 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.