Plasmide CRISPR d'Activation (m) LMP7: sc-421450-ACT

Psmb8 code chez la souris la sous-unité catalytique de l’immunoprotéasome LMP7 (β5i), un composant clé du protéasome 20S inductible par l’IFN-γ, qui remodèle la spécificité protéolytique pendant l’inflammation. LMP7 favorise la génération de peptides présentés par le CMH de classe I et soutient le traitement et la présentation des antigènes, reliant ainsi la protéostasie à la surveillance immunitaire adaptative. En influençant des programmes inflammatoires associés à NF-κB et les réponses cellulaires au stress induit par les cytokines, l’activité de Psmb8 affecte la différenciation des cellules immunitaires et leurs états d’activation. Un fonctionnement dérégulé de l’immunoprotéasome a été associé à une présentation antigénique aberrante et à des phénotypes inflammatoires chroniques, faisant de Psmb8 une cible pertinente pour la recherche en immunologie et en protéostasie dans des modèles murins.

LMP7 Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Psmb8 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

LMP7 Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Psmb8 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Psmb8, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de LMP7. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Psmb8 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de LMP7 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie LMP7 dans les cellules tumorales présentant une expression de Psmb8 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.