Plasmide CRISPR d'Activation (h) KCNMB4: sc-405044-ACT

KCNMB4 code la sous-unité auxiliaire β4 des canaux potassiques (BK) à grande conductance, activés par le calcium et le voltage, en modulant la cinétique d’ouverture/fermeture (gating) du canal, sa sensibilité au calcium et l’excitabilité membranaire. Dans les neurones humains et d’autres tissus excitables, KCNMB4 contribue à ajuster le déclenchement des potentiels d’action et la repolarisation dépendante du Ca2+, en s’intégrant à la signalisation calcique et à l’homéostasie électrophysiologique. En façonnant le comportement des canaux BK, il influence des processus tels que la neurotransmission, l’adaptation de la fréquence de décharge et les voies de signalisation dépendantes de l’activité liées à la régulation des canaux ioniques. Une composition dérégulée des canaux BK, notamment une expression modifiée des sous-unités β, est impliquée dans des phénotypes neurologiques où l’équilibre de l’excitabilité est perturbé, ce qui étaye l’intérêt de KCNMB4 pour des études mécanistiques des canalopathies et du stress cellulaire induit par l’hyper-/hypoexcitabilité.

KCNMB4 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de KCNMB4 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

KCNMB4 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus KCNMB4 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription KCNMB4, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de KCNMB4. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus KCNMB4 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de KCNMB4 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie KCNMB4 dans les cellules tumorales présentant une expression de KCNMB4 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.