Plásmido CRISPR de Activación (h) Cystinosin: sc-405040-ACT

CTNS codifica la cistinosina, un transportador de membrana lisosomal que media el eflujo de cistina desde la luz del lisosoma hacia el citosol, contribuyendo al equilibrio redox intracelular y a la homeostasis de aminoácidos. Al regular la eliminación de cistina lisosomal, la cistinosina conecta la función del lisosoma con procesos metabólicos más amplios, incluidas la dinámica autofagia-lisosoma y las respuestas al estrés celular. La alteración de la actividad de CTNS perturba el almacenamiento lisosomal y las vías posteriores de proteostasis, lo que la convierte en un nodo clave para estudiar el control de calidad de los orgánulos y la adaptación metabólica. CTNS está implicado en la disfunción lisosomal asociada a la cistinosis y se examina con frecuencia en modelos de fisiología del túbulo proximal renal y del transporte sistémico de aminoácidos.

Cystinosin El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de CTNS sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Cystinosin El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus CTNS en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional CTNS, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Cystinosin. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo CTNS y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Cystinosin en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Cystinosin en células tumorales con expresión de CTNS silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.