BCKDE1A CRISPR Activation Plasmid (h): sc-417950-ACT

BCKDHA kodiert die E1α‑Untereinheit des verzweigtkettigen α‑Ketosäure‑Dehydrogenase‑(BCKDH-)Komplexes, eines mitochondrialen Multienzymsystems, das die oxidative Decarboxylierung verzweigtkettiger α‑Ketosäuren katalysiert, die aus Leucin, Isoleucin und Valin hervorgehen. Diese Reaktion ist zentral für den Abbau verzweigtkettiger Aminosäuren und verknüpft den Nährstoffstatus mit der Bildung von Acetyl‑CoA bzw. Succinyl‑CoA, dem mitochondrialen Redoxgleichgewicht und dem zellulären Energiestoffwechsel. Die BCKDH‑Aktivität wird streng durch Phosphorylierung und Dephosphorylierung reguliert und integriert Signale von BCKDK und PPM1K, um den metabolischen Fluss zu modulieren. Eine Fehlregulation von BCKDHA und eine beeinträchtigte BCKDH‑Funktion sind mit angeborenen Stoffwechselstörungen assoziiert und werden im Kontext mitochondrialer Dysfunktion und veränderter Aminosäurehomöostase breit untersucht.

BCKDE1A Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen BCKDHA-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

BCKDE1A Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des BCKDHA-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der BCKDHA-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen BCKDE1A-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native BCKDHA-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von BCKDE1A-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des BCKDE1A-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem BCKDHA-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.