Plasmide CRISPR d'Activation (m) Atg16: sc-429488-ACT

Le gène murin Atg16l1 code Atg16, un composant central du complexe ATG12–ATG5–ATG16L1, qui coordonne la biogenèse des autophagosomes via la lipidation de LC3 et l’expansion du phagophore. Cette protéine fait le lien entre les signaux amont liés aux nutriments et au stress et l’autophagie sélective comme non sélective, influençant le contrôle qualité des mitochondries, les réponses antimicrobiennes et les sorties de signalisation inflammatoire. Une fonction altérée d’ATG16L1 est associée à la biologie de la barrière intestinale et à la régulation de l’immunité innée, ce qui la rend pertinente pour l’étude des interactions hôte–microbe, des phénotypes inflammatoires et de l’adaptation au stress intrinsèque des cellules. Dans les systèmes expérimentaux, la perturbation d’Atg16l1 peut moduler le flux autophagique et les voies cytokiniques en aval, permettant une dissection mécanistique de l’homéostasie dépendante de l’autophagie.

Atg16 Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Atg16l1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Atg16 Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Atg16l1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Atg16l1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Atg16. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Atg16l1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Atg16 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Atg16 dans les cellules tumorales présentant une expression de Atg16l1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.