Acid Ceramidase Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401495-ACT

ASAH1 codifica a ceramidase ácida, uma hidrolase lisossomal que desacetila a ceramida para gerar esfingosina e ácidos graxos livres, regulando assim o equilíbrio entre a ceramida e a sinalização por esfingosina-1-fosfato. Essa enzima é central no metabolismo dos esfingolipídios, influenciando a renovação de membranas, a homeostase endolisossomal, a autofagia e vias responsivas ao estresse que moldam a sobrevivência celular e a sinalização inflamatória. A atividade de ASAH1 modula a apoptose dependente de ceramida e a transdução de sinais mediada por lipídios, conectando a função lisossomal a uma adaptação metabólica mais ampla. A desregulação de ASAH1 e da ceramidase ácida tem sido associada à patologia de armazenamento lisossomal e a perfis de esfingolipídios alterados observados em fenótipos celulares relevantes para neurodegeneração e câncer, reforçando seu valor como alvo mecanístico de pesquisa.

Acid Ceramidase O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de ASAH1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Acid Ceramidase O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus ASAH1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição ASAH1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Acid Ceramidase. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus ASAH1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Acid Ceramidase no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Acid Ceramidase em células tumorais com expressão de ASAH1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.