CRISPR Systeme
Santa Cruz Biotechnology now offers target-specific CRISPR/Cas9 Knockout (KO) Plasmids, CRISPR Double Nickase Plasmids, CRISPR/ dCas9 Activation Plasmids and CRISPR Lenti Activation Systems for over 18,910 human and 18,340 mouse protein encoding genes.
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Geschichte von CRISPR/Cas9
Die CRISPR/Cas-System ist ein von Archaeen und Bakterien verwendeter adaptiver Abwehrmechanismus ähnlich eines Immunsystems zum Abbau von fremden genetischem Material. In diesen Organismen wird von Phagen injiziertes genetisches Material in spezielle CRISPR Loci integriert (1,2). Das neue Genmaterial, auch Spacer genannt, erzeugt ein sequenzspezifisches Fragment welches zur Erkennung einer zukünftigen Phageninfektion verwendet werden kann. Dazu werden die Spacer in kurze CRISPR RNAs (crRNAs) translatiert. Diese fungieren als Orientierungshilfe für den spezifischen Abbau der komplementären Phagen DNA durch die Nuklease Cas, welche ebenfalls auf dem CRISPR Locus kodiert wird (1,2). Pre-crRNA bindet tracrRNA (trans-activierende crRNA) und der RNA-Duplex wird von RNAse III prozessiert. Der entstandende crRNA/tracrRNA-Hybrid, geht als gRNA einen Komplex mit der Cas9 Nuklease ein. Dies geschieht indem sie an die Brückenhelix im REC Bereich des Enzyms bindet und das Rückgrat der crRNA zahlreiche Salzbrücken mit dem Protein ausbildet (1,2,3). Die Cas9 Nuklease des Typ II CRISPR Systems verfügt über eine RNA Bindedomäne, einen Bereich zur Erkennung von Alpha-Helizes, eine Domäne mit Endonuklease-Aktivität sowie eine Domäne zur Erkennung von "protospacer adjacent motif" (PAM) Elementen der DNA (1,2). CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) sind DNA-Abschnitte mit gleichmäßig verteilter, sich wiederholender DNA-Sequenz, die von vorn und von hinten abgelesen, gleich lautend sind.
Sobald die crRNA an Cas9 gebunden ist, verändert das Enzym seine Konformation und bildet einen Kanal für die Bindung an die DNA (1,2,3). Der Cas9/crRNA Komplex durchsucht dann die DNA nach PAM Elementen (4,5,6). Bei Erkennen eines PAM Elements wird die DNA entspannt, und die crRNA kann die benachbarte Sequenz auf Komplementarität überprüfen. Sobald Cas9 an das PAM Element neben der crRNA-komplementären DNA Sequenz gebunden hat, bildet die Brückenhelix im REC Bereich des Enzyms einen DNA-RNA Heteroduplex mit dem Zielgen (3,4,7). Das Erkennen des PAM Elements durch Cas9 aktiviert die nukleolytischen HNH und RuvC Domänen des Enzyms, welche einen Doppelstrangbruch (DSB) in der DNA-Zielsequenz verursachen. Dies führt zum Abbau der betroffenen DNA (1,2,5,8). Falls die vorhandene crRNA nicht komplementär zur DNA an dieser Position ist, verlässt Cas9 seine Position wieder und sucht nach einem anderen PAM Element (7). Ein entstandener Doppelstrangbruch in der DNA kann mittels nicht-homologer Endverknüpfung (NHEJ) geschlossen werden, welche durch zufälliges Einfügen oder Entfernen (InDels) von Nukleotiden Fehler in der genetischen Information erzeugt (Punktmutation). Alternativ ist eine homologe Rekombination (HR bzw. HDR) möglich. Bei diesem Mechanismus können beliebige Gene, z.B. auch Selektionsmarker an der entsprechenden Stelle im Genom eingebaut werden (2,9,10). Der CRISPR/Cas9 Mechanismus kann für die genomische Modifikation von verschiedenen Systemen, einschließlich Säugerzellen, umfunktioniert werden.
Gene-Editing mittels Doppelstrangbrüchen kann mit Hilfe von sog. Designer-Nukleasen wie Meganukleasen, Zinkfingernukleasen (ZFNs = Zink-Finger-Nukleases) oder Transkriptionsaktivator-ähnlichen Effektornukleasen (TAL-Effektoren oder TALENs = Transcription Activator-like Effector Nucleases) erfolgen. Jedoch gibt es bei diesen Methoden Einschränkungen. Bei der Verwendung von Meganukleasen lässt sich eine spezifische Erkennung der Zielsequenz vom Enzym nur schwer nachweisen. ZFNs und TALENs unterscheiden sich in der Beschaffenheit der DNA-Bindedomänen. Beide sind schwierig zu designen und beide erkennen maximal eine kurze Zielsequenz von 3nt Länge. Bei CRISPR/Cas9 hingegen lassen sich einzelne guide RNAs (sgRNAs) relativ einfach designen. Diese gRNAs übernehmen in den K/O Experimenten die Funktion der in der Natur vorkommenden crRNAs. Sie können zur zielgerichteten Modifikation von DNA Loci parallel zur Cas9 Nuklease vom selben Vektor expremiert werden. Das CRISPR/Cas9 System verfügt außerdem über eine höhere Sensitivität und es ist im Screening effizienter als small hairpin RNAs. Für die Anwendung in Säugerzellen wird heute von vielen Laboren das CRISPR/Cas9 System bevorzugt.
Ein deutlicher Vorteil des CRISPR/Cas9 Systems ist die hohe Effizienz bei der Erzeugung eines Dopplestrangbruches in der genomischen DNA. Aufgrund verschiedener off-target Effekte kann die beschrieben hohe Effizienz des CRISPR/Cas9 Systems zu einer reduzierten Spezifität führen. Eine deutlich höhere Spezifität kann durch den Einsatz des CRISPR Double Nickase Systems erreicht werden. Double Nickase Plasmide nutzen Plasmidpaare die für eine Nickase (Cas9n) kodieren (eine D10A mutierte Cas9 Nuklease) sowie je eine unterschiedliche zielspezifische single guide RNA (sgRNA) Sequenz (12). Der Cas9n/sgRNA-Komplex erzeugt einen Einzelstrangbruch der Ziel-DNA komplementär zur jewiligen sgRNA-Vorlage (12). Die Zielsequenzen der sgRNA liegen ca. 20 Basenpaare auseinander und richten sich gegen jeweils einen der beiden gegenüberliegenden Stränge der Ziel-DNA. Die räumliche Trennung der DNA-Einzelstränge durch den Cas9n/sgRNA-Komplex verhindert eine Reparatur anhand des jeweiligen Komplementärstranges. Der so erzeugte zweifache Einzelstrangbruch (Double Nick) ahmt damit im Resultat den Effekt eines Doppelstrangbruchs nach (12). Der Einsatz von sgRNA-Paaren erlaubt eine erhöhte Spezifität des Cas9-vermittelten Gen-Editing bei gleichzeitig hoher Effizient (12).
Das CRISPR System wurde im Labor ursprünglich für Gene-Editing eingesetzt. Eine Weiterentwicklung ermöglicht nun die ebenso einfache wie schnelle Aktivierung der Genexpression (13). Verschiedene Komponenten des CRISPR Systems wurden verändert, um einen Mediator-Komplex zur synergistischen Gen-Aktivierung (SAM-Komplex; synergistic activation mediator complex) zu erschaffen. Das Resultat ist ein hoch spezifisches und effizientes System zur Transkriptionsaktivierung (13). Ein Bestandteil des SAM-Komplex ist die veränderte Cas9 Endonuklease. Eine in den katalytischen Domänen deaktivierte dCas9 wurde mit der Transkriptionsaktivierungsdomäne VP64 fusioniert. Gebunden an zielsequenz-spezifische guide RNA (sgRNA), bindet der Komplex aus dCas9-VP64-sgRNA die -200bp Region vom Transkriptionsstartsignal des endogenen Zielgens um dessen Expression hoch zu regulieren (13). Um die Aktivierung der Transkription des Zielgens noch weiter zu stiegern wurde die sgRNA dahin gehend verändert, dass ein kleiner Hairpin Aptamer am Tetraloop und Stem loop 2 angehängt wurde (13). Ein Aptamer ist ein kurzes einzelsträngiges Oligonukleotid, welches über die 3D-Struktur Moleküle binden kann. Dieser der sgRNA hinzu gefügte Aptamer bindet selektiv demerisiertes Bakteriophagen-Hüllprotein MS2 (13). Das MS2 wurde fusioniert mit den p65 und HSF1 Transaktivierungsdomänen. Das resultierende Fusionsprotein MS2-P65-HSF1 erhöht die Rekrutierung von Transkriptionsfaktoren und verstärkt dadurch die Wirkung der dCas9-vermittelten Genaktivierung (13). Produkte für die Aktivierung der Genexpression werden sowohl als Standard-Plasmide für die Transfektion als auch als Lentiviral-Plasmide für eine effiziente Einschleusung des SAM-Komplex in alle Zelltypen (13).
Quick Links
CRISPR/Cas9-induzierter DNA-Doppelstrangbruch (DSB)
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