Sar1a CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404190-ACT

Das humane Gen **SAR1A** kodiert **Sar1a**, eine kleine COPII-assoziierte GTPase, die das Abschnüren von Transportvesikeln aus dem endoplasmatischen Retikulum (ER) initiiert und den Transport vom ER zum Golgi-Apparat unterstützt. Durch den Wechsel zwischen GDP- und GTP-gebundenen Zuständen rekrutiert Sar1a die Coat-Komponenten **Sec23/24** und **Sec13/31**, um Frachtauswahl, Vesikelkrümmung und sekretorischen Durchsatz zu regulieren. Der SAR1A-abhängige Transport überschneidet sich mit Proteostase-Pathways einschließlich ER-Stress-Signalgebung und der **unfolded protein response (UPR)** und beeinflusst so den zellulären Umgang mit Membran- und sekretorischen Proteinen. Fehlregulierte Dynamiken des sekretorischen Weges und der ER-Homöostase werden häufig mit krankheitsrelevanten Phänotypen in Verbindung gebracht, etwa veränderter Ablagerung extrazellulärer Matrix, aberrantem Rezeptor-Transport und stressadaptiver Signalgebung in transformierten Zellen.

Sar1a Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen SAR1A-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Sar1a Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des SAR1A-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der SAR1A-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Sar1a-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native SAR1A-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Sar1a-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Sar1a-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem SAR1A-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.