PTEN CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400103-ACT

PTEN kodiert eine Lipid- und Proteinphosphatase, die der PI3K-Signalgebung entgegenwirkt, indem sie PIP3 dephosphoryliert und dadurch die AKT-Aktivierung sowie nachgeschaltete, mTOR‑abhängige Wachstumsprogramme begrenzt. Über diese Aktivität reguliert PTEN die Zellzyklusprogression, den Stoffwechsel, das Überleben und die Migration von Zellen und trägt zur Aufrechterhaltung der genomischen Stabilität und der Gewebehomöostase bei. Die PTEN‑Funktion ist in Signalwege eingebunden, die die epitheliale Polarität und die Zytoskelettdynamik steuern, und beeinflusst dadurch Adhäsion und invasives Verhalten. Eine Fehlregulation der PTEN‑Expression oder -Aktivität ist häufig mit onkogener Signalgebung sowie veränderten Immun- und Entwicklungsprozessen verbunden, was PTEN zu einem häufig genutzten Knotenpunkt für mechanistische Studien zur Umverdrahtung von Signalwegen macht.

PTEN Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PTEN-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

PTEN Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PTEN-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PTEN-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen PTEN-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PTEN-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von PTEN-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des PTEN-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PTEN-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.