NKp30 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403117-ACT

NCR3 kodiert NKp30, einen aktivierenden Rezeptor, der auf natürlichen Killerzellen (NK-Zellen) und auf Teilpopulationen angeboren‑ähnlicher T‑Zellen exprimiert wird und durch die Erkennung stressinduzierter Liganden auf Zielzellen zur Immunüberwachung beiträgt. Die Bindung von NKp30 löst über assoziierte Adaptermoleküle eine ITAM‑abhängige Signalübertragung aus und fördert nachgeschaltete Signalwege wie die Aktivierung von SYK/ZAP70, Calcium‑Flux, MAPK‑Signalisierung, die Exozytose zytotoxischer Granula und die Zytokinproduktion. Veränderte Expression oder Funktion von NCR3/NKp30 wurde mit Unterschieden in der Reaktionsfähigkeit von NK‑Zellen in Tumormikroumgebungen und während viraler Infektionen in Verbindung gebracht und wird häufig im Kontext von Immunflucht und Entzündung untersucht. Als Oberflächenrezeptor, der zentral für die Aktivierung angeborener Effektormechanismen ist, bietet NKp30 einen gut untersuchbaren Ansatzpunkt, um Signalierungsschwellen sowie die Rezeptor‑Ligand‑Biologie in menschlichen Immunzellen zu analysieren.

NKp30 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen NCR3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

NKp30 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des NCR3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der NCR3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen NKp30-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native NCR3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von NKp30-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des NKp30-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem NCR3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.