LLH1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-404079-ACT

O PLOD1 humano codifica a lisil-hidroxilase 1 (LLH1), uma dioxigenase dependente de Fe2+/2-oxoglutarato residente no RE (retículo endoplasmático) que hidroxila resíduos de lisina no procolágeno, um pré-requisito para uma reticulação intermolecular estável e para a montagem adequada da matriz extracelular. Ao regular a maturação do colágeno, a LLH1 influencia a mecânica da matriz, a sinalização célula–matriz e processos de remodelação tecidual que se cruzam com programas associados à fibrose e ao reparo de feridas. A atividade alterada de PLOD1 perturba a fibrilogênese do colágeno e a organização da membrana basal, e tem sido associada a fenótipos de fragilidade do tecido conjuntivo e a uma desregulação mais ampla da matriz observada em diversos contextos patológicos. Como resultado, PLOD1/LLH1 é frequentemente investigado em estudos de biossíntese de colágeno, proteostase do RE e modulação do comportamento celular dirigida pela MEC.

LLH1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de PLOD1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

LLH1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus PLOD1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição PLOD1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de LLH1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus PLOD1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de LLH1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via LLH1 em células tumorais com expressão de PLOD1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.