Plasmide CRISPR d'Activation (m) LKB1: sc-423192-ACT

Le gène murin Stk11 code la kinase sérine/thréonine LKB1, un régulateur majeur de l’homéostasie énergétique cellulaire qui phosphoryle et active les kinases de la famille AMPK. Via AMPK et des voies apparentées, LKB1 coordonne les réponses au stress métabolique, la fonction mitochondriale, l’autophagie, la polarité cellulaire et le contrôle du cycle cellulaire, en intégrant la détection des nutriments à la régulation de la croissance par la signalisation mTOR. La perturbation ou la dérégulation de la signalisation de LKB1 est largement associée à un métabolisme altéré et à une perte de polarité dans des contextes pertinents pour les maladies, faisant de Stk11 un nœud clé pour étudier l’adaptation au stress et l’homéostasie tissulaire. Dans des modèles murins, la modulation de Stk11/LKB1 permet d’explorer les mécanismes de reprogrammation métabolique et les interactions entre voies de signalisation dans divers types cellulaires.

LKB1 Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Stk11 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

LKB1 Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Stk11 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Stk11, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de LKB1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Stk11 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de LKB1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie LKB1 dans les cellules tumorales présentant une expression de Stk11 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.