KIR4.1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402244-ACT

KCNJ10 kodiert den inward-rectifying Kaliumkanal KIR4.1, einen zentralen Determinanten des Membranpotenzials und der Kaliumpufferung in glialen und epithelialen Kontexten. Im zentralen Nervensystem unterstützt KIR4.1 die Clearance von extrazellulärem K+ und das räumliche Puffern, was mit der neuronalen Erregbarkeit, der Homöostase von Astrozyten sowie Prozessen der Ionen-/Wasserkopplung verknüpft ist. Die Kanalaktivität trägt zur Aufrechterhaltung elektrochemischer Gradienten bei und beeinflusst nachgeschaltete Signalwege über Veränderungen des Ruhemembranpotenzials und der zellulären Erregbarkeit. Genetische und funktionelle Störungen von KCNJ10 wurden mit neuroentwicklungsbezogenen und anfallsassoziierten Phänotypen in Verbindung gebracht, was seine Relevanz für Studien zu Ionenkanal-Dysfunktion und Glia-Biologie unterstreicht.

KIR4.1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen KCNJ10-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

KIR4.1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des KCNJ10-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der KCNJ10-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen KIR4.1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native KCNJ10-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von KIR4.1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des KIR4.1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem KCNJ10-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.