Plasmide CRISPR d'Activation (h) KIR4.1: sc-402244-ACT

KCNJ10 code le canal potassique rectifiant entrant KIR4.1, un déterminant clé du potentiel de membrane et de la mise en tampon du potassium dans les contextes gliaux et épithéliaux. Dans le système nerveux central, KIR4.1 participe à l’élimination du K+ extracellulaire et au tamponnement spatial liés à l’excitabilité neuronale, à l’homéostasie des astrocytes et aux processus de couplage ions/eau. L’activité du canal s’inscrit dans le maintien des gradients électrochimiques et influence la signalisation en aval via des modifications du potentiel de repos et de l’excitabilité cellulaire. Des perturbations génétiques et fonctionnelles de KCNJ10 ont été associées à des phénotypes neurodéveloppementaux et à des manifestations épileptiques, ce qui confirme sa pertinence pour l’étude des dysfonctions des canaux ioniques et de la biologie gliale.

KIR4.1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de KCNJ10 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

KIR4.1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus KCNJ10 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription KCNJ10, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de KIR4.1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus KCNJ10 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de KIR4.1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie KIR4.1 dans les cellules tumorales présentant une expression de KCNJ10 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.