ITF Plasmide di attivazione CRISPR (h2): sc-416266-ACT-2

Il TFF3 umano (trefoil factor 3) codifica il peptide secreto ITF, un fattore trefoil associato alle mucine altamente espresso nell’epitelio intestinale e in altri epiteli mucosali, dove sostiene l’integrità della barriera promuovendo la restituzione epiteliale, la migrazione e le risposte di riparazione nelle aree adiacenti alle lesioni. TFF3/ITF interagisce con i componenti del muco e modula la segnalazione legata al rimodellamento del citoscheletro e ai programmi di sopravvivenza, inclusi i processi associati a MAPK/ERK e PI3K/AKT, influenzando così il mantenimento delle giunzioni cellula-cellula e l’adattamento allo stress infiammatorio. Un’espressione disregolata di TFF3 è stata riportata in contesti di danno della mucosa e infiammazione cronica ed è frequentemente studiata nei disturbi gastrointestinali così come nei tumori epiteliali, dove può correlare con fenotipi di differenziazione alterata, invasione e metastasi. L’editing genetico di TFF3 consente la dissezione meccanicistica delle vie di riparazione della mucosa, del crosstalk epitelio-immunitario e del contributo dei fattori secreti a modelli di organoidi, barriera e microambiente tumorale.

ITF Il plasmide di attivazione CRISPR (h2) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di TFF3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ITF Il plasmide di attivazione CRISPR (h2) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus TFF3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione TFF3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ITF. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus TFF3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ITF nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ITF nelle cellule tumorali con espressione di TFF3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.