IscU1/2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402325-ACT

Das humane **ISCU**-Gen kodiert die Scaffold-Proteine **IscU1/2**, die die de-novo-Biogenese von Eisen-Schwefel-(Fe–S)-Clustern in Mitochondrien und im Zytosol koordinieren und so die Reifung Fe–S-abhängiger Enzyme unterstützen, die an der oxidativen Phosphorylierung, der Aktivität des TCA-Zyklus und der DNA-Erhaltung beteiligt sind. Als transiente Montageplattform für die Übertragung von Clustern auf Zielproteine verbindet IscU1/2 den mitochondrialen Stoffwechsel mit der Redoxhomöostase und zellulären Stressantworten. Störungen der ISCU-Expression oder des Spleißens beeinträchtigen die Funktion von Fe–S-Enzymen, mit nachgelagerten Effekten auf Energieproduktion und Eisenhaushalt, und wurden mit mitochondrialer Myopathie sowie breiteren neuromuskulären und metabolischen Phänotypen in Verbindung gebracht. Diese Eigenschaften machen ISCU zu einem relevanten Knotenpunkt für die Untersuchung der mitochondrialen Proteostase, des Eisenstoffwechsels und der metabolischen Anpassung in humanen Zellmodellen.

IscU1/2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ISCU-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

IscU1/2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ISCU-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ISCU-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen IscU1/2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ISCU-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von IscU1/2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des IscU1/2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ISCU-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.