IRP-1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401817-ACT

O ACO1 humano codifica a proteína reguladora de ferro 1 (IRP-1), um fator citosólico bifuncional que alterna entre uma forma de aconitase enzimaticamente ativa e um regulador de ligação a RNA, dependendo do estado do seu cluster [4Fe-4S]. Na forma de IRP-1, liga-se a elementos responsivos ao ferro (IREs) em mRNAs-alvo para coordenar a captação, o armazenamento e a utilização de ferro, modulando a tradução e a estabilidade do mRNA e integrando a biogénese de clusters ferro-enxofre com programas celulares redox e metabólicos. Por meio desta rede de controlo pós-transcricional, o ACO1 ajuda a manter a homeostase do ferro e influencia vias associadas à função mitocondrial, respostas ao stress oxidativo e montagem de proteínas heme e ferro-enxofre. A desregulação da sinalização IRP-1/IRE e alterações na atividade do ACO1 são frequentemente estudadas em contextos de sobrecarga de ferro ou restrição de ferro, biologia relacionada com anemia e remodelação metabólica associada à neurodegeneração e ao cancro.

IRP-1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de ACO1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

IRP-1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus ACO1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição ACO1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de IRP-1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus ACO1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de IRP-1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via IRP-1 em células tumorais com expressão de ACO1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.