GRP 75 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400471-ACT

HSPA9 kodiert GRP75 (Mortalin), ein mit den Mitochondrien assoziiertes Chaperon der HSP70-Familie, das den Proteinimport, die Faltung und die Proteostase in der mitochondrialen Matrix unterstützt. GRP75 trägt zur mitochondrialen Bioenergetik, zur Assemblierung von Eisen-Schwefel-Clustern und zu stressadaptiver Signalgebung bei und ist zudem an der Kommunikation zwischen Mitochondrien und ER beteiligt, die die Calciumhandhabung und die Redoxhomöostase beeinflusst. Über diese Funktionen ist HSPA9 mit Signalwegen verknüpft, die die mitochondriale Qualitätskontrolle, die Empfindlichkeit gegenüber Apoptose sowie zelluläre Antworten auf oxidativen und proteotoxischen Stress steuern. Eine fehlregulierte GRP75-Aktivität und -Expression wurde in experimentellen Systemen mit veränderter mitochondrialer Funktion und Phänotypen in Zusammenhang gebracht, die für Neurodegeneration, hämatopoetische Dysfunktion und die Krebsbiologie relevant sind.

GRP 75 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen HSPA9-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

GRP 75 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des HSPA9-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der HSPA9-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen GRP 75-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native HSPA9-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von GRP 75-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des GRP 75-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem HSPA9-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.