Plásmido CRISPR de Activación (h) Gephyrin: sc-401197-ACT

El GPHN humano codifica la gefirina, una proteína de andamiaje multifuncional que ancla receptores de neurotransmisores inhibitorios en las membranas postsinápticas y organiza nanodominios de señalización críticos para la transmisión sináptica. La gefirina se une a los receptores GABA\_A y de glicina y los estabiliza, y además interactúa con componentes del citoesqueleto y del tráfico intracelular para regular el agrupamiento de receptores, la maduración de la sinapsis y la plasticidad. Más allá de su función sináptica, la gefirina participa en la biosíntesis del cofactor de molibdeno, vinculándola con la actividad de enzimas redox esenciales y con la homeostasis metabólica celular. La desregulación de la expresión de GPHN o de la organización de receptores dependiente de gefirina se ha asociado con alteraciones en la función de los circuitos inhibitorios y es relevante para fenotipos del neurodesarrollo y relacionados con convulsiones en estudios mecanísticos.

Gephyrin El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de GPHN sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Gephyrin El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus GPHN en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional GPHN, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Gephyrin. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo GPHN y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Gephyrin en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Gephyrin en células tumorales con expresión de GPHN silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.