EWS Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401036-ACT

EWSR1 codifica a proteína EWS, uma proteína ligante de RNA e membro da família FET, que conecta a regulação da transcrição ao processamento de RNA. A EWS participa do splicing co-transcricional, do transporte de mRNA e da dinâmica de grânulos de estresse, além de interagir com programas de transcrição dependentes da RNA polimerase II para modular a expressão gênica. Rearranjos cromossômicos envolvendo EWSR1 geram proteínas de fusão oncogênicas que reprogramam redes transcricionais e são centrais para a biologia do sarcoma de Ewing e de tumores relacionados de tecidos moles. Alterações na função de EWSR1 também estão associadas a defeitos mais amplos na estabilidade do genoma e no metabolismo de RNA, relevantes para estudos mecanísticos de transformação e diferenciação celular.

EWS O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de EWSR1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

EWS O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus EWSR1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição EWSR1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de EWS. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus EWSR1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de EWS no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via EWS em células tumorais com expressão de EWSR1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.