Plásmido CRISPR de Activación (h) COL8A2: sc-403831-ACT

COL8A2 codifica la cadena alfa 2 del colágeno tipo VIII, un colágeno no fibrilar de cadena corta que contribuye a la organización de la matriz extracelular y a estructuras asociadas a la membrana basal. En los tejidos oculares está enriquecido en el endotelio corneal y en la membrana de Descemet, donde favorece el ensamblaje de la matriz, la adhesión celular y la integridad biomecánica. La remodelación de la matriz asociada a COL8A2 se integra con vías que regulan la señalización célula–matriz, incluida la adhesión mediada por integrinas y el recambio de la matriz extracelular. La variación genética o la expresión desregulada de COL8A2 se ha vinculado con distrofias endoteliales corneales, lo que lo convierte en un objetivo relevante para estudiar la homeostasis de la matriz extracelular y la función de las células endoteliales.

COL8A2 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de COL8A2 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

COL8A2 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus COL8A2 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional COL8A2, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de COL8A2. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo COL8A2 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de COL8A2 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía COL8A2 en células tumorales con expresión de COL8A2 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.