Plasmide CRISPR d'Activation (h) CD3-δ: sc-401519-ACT

CD3D code pour CD3-δ, un composant central du complexe récepteur des cellules T (TCR)–CD3, indispensable à l’activation des lymphocytes T dépendante de l’antigène et à la propagation du signal. CD3-δ participe à l’assemblage et à l’expression à la surface du complexe TCR et transmet les signaux via son motif ITAM cytoplasmique, en recrutant LCK/ZAP70 et des voies en aval telles que LAT/SLP-76, PLCγ1–NFAT, NF-κB et MAPK/ERK, afin de coordonner la prolifération et les programmes de cytokines. Une expression ou une fonction altérée de CD3D peut perturber le développement des thymocytes, la compétence de signalisation du TCR et l’homéostasie immunitaire, ce qui en fait une cible pertinente pour l’étude des immunodéficiences, de la dysrégulation immunitaire et des interactions tumeur–système immunitaire. En tant que marqueur définissant la lignée des cellules T, CD3-δ est aussi largement utilisé pour modéliser les seuils de signalisation du récepteur et les états d’activation dans les cellules immunitaires humaines.

CD3-δ Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de CD3D sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

CD3-δ Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus CD3D dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription CD3D, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de CD3-δ. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus CD3D natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de CD3-δ au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie CD3-δ dans les cellules tumorales présentant une expression de CD3D silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.