CCNB1/cyclin B1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400114-ACT

CCNB1 kodiert Cyclin B1, eine zentrale regulatorische Untereinheit des CDK1-Komplexes, der den Übergang von G2 nach M antreibt und den Eintritt in die Mitose koordiniert. Die Akkumulation von Cyclin B1 und seine Translokation in den Zellkern fördern die Chromosomenkondensation, den Abbau der Kernhülle und den Aufbau des mitotischen Spindelapparats, während der rechtzeitige ubiquitinvermittelte Abbau durch den APC/C den Austritt aus der Mitose unterstützt. Die CCNB1-Aktivität ist in DNA-Schadens-Checkpoints und Zellzyklus-Überwachungswege eingebunden, um eine fehlerfreie Genomreplikation und -segregation sicherzustellen. Eine dysregulierte CCNB1-Expression ist häufig mit aberranter Proliferation, chromosomaler Instabilität und tumorassoziierten Zellzyklus-Phänotypen verbunden, weshalb CCNB1 in Studien zur Mitosekontrolle weithin als Marker und mechanistischer Knotenpunkt verwendet wird.

CCNB1/cyclin B1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CCNB1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

CCNB1/cyclin B1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CCNB1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CCNB1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen CCNB1/cyclin B1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CCNB1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von CCNB1/cyclin B1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des CCNB1/cyclin B1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CCNB1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.