Plásmido CRISPR de Activación (h) BRAF: sc-400121-ACT

BRAF codifica una quinasa de proteínas de serina/treonina que actúa como un efector clave en la cascada de señalización RAS–RAF–MEK–ERK (MAPK), transmitiendo señales desde receptores tirosina quinasa activados hacia programas transcripcionales nucleares. Al regular la progresión del ciclo celular, la diferenciación, la supervivencia y las respuestas al estrés, BRAF integra señales extracelulares en cambios de expresión génica dependientes del contexto. La actividad desregulada de BRAF altera la salida de la vía MAPK y se asocia estrechamente con la señalización oncogénica, cambios en la plasticidad celular y fenotipos de respuesta terapéutica en diversos modelos tumorales. Dado que la señalización MAPK presenta interacciones cruzadas con PI3K/AKT y con reguladores de retroalimentación como las fosfatasas DUSP y las proteínas SPRY, BRAF se estudia ampliamente para comprender la dinámica de la vía, la adaptación de la señalización y los mecanismos de resistencia.

BRAF El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de BRAF sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

BRAF El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus BRAF en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional BRAF, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de BRAF. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo BRAF y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de BRAF en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía BRAF en células tumorales con expresión de BRAF silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.