B7RP-1 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-424469-ACT

Das Mausgen *Icosl* kodiert den kostimulatorischen Liganden B7RP-1 (ICOSL/CD275), ein Mitglied der Immunglobulin-Superfamilie, das auf antigenpräsentierenden Zellen sowie in einigen nicht-hämatopoetischen Stromakompartimenten exprimiert wird. Die Bindung von ICOS an aktivierten T-Zellen fördert eine PI3K-abhängige Signalübertragung, die die Differenzierung follikulärer T-Helferzellen, Keimzentrumsreaktionen und die Produktion isotypenwechselnder Antikörper unterstützt und damit ICOSL mit der Regulation der adaptiven Immunpolarisation verknüpft. ICOSL-vermittelte Kommunikation beeinflusst zudem Zytokinnetzwerke, die das Th1/Th2/Th17-Gleichgewicht und das Trafficking von Immunzellen innerhalb lymphoider Gewebe prägen. Eine fehlregulierte ICOS–ICOSL-Signalgebung wird häufig in Modellen von Autoimmunität, chronischer Entzündung, Allergie und tumorassoziierter Immunmodulation untersucht, in denen veränderte Kostimulation humorale und zelluläre Immunantworten verschieben kann.

B7RP-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Icosl-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

B7RP-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Icosl-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Icosl-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen B7RP-1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Icosl-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von B7RP-1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des B7RP-1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Icosl-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.