Arrestin-C CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403284-ACT

ARR3 kodiert Arrestin‑C, ein in Zapfen‑Photorezeptoren angereichertes Arrestin, das an phosphorylierte, lichtaktivierte Opsine bindet, um die G‑Protein‑Signalübertragung zu beenden und die Rezeptordesensibilisierung innerhalb der Phototransduktionskaskade zu erleichtern. Durch die Regulation der GPCR‑Deaktivierung und des Rezeptor‑Traffickings trägt Arrestin‑C dazu bei, Signalamplitude und Erholungskinetik in retinalen Zapfen zu formen und unterstützt die visuelle Adaptation. Eine Fehlregulation der Zapfen‑GPCR‑Signalgebung und der arrestinvermittelten Abschaltung wurde mit retinalen Funktionsstörungen in Verbindung gebracht, wodurch ARR3 einen nützlichen molekularen Ansatzpunkt für die Untersuchung von GPCR‑Arrestin‑Interaktionen und der zapfenspezifischen Kontrolle der Signalübertragung darstellt. ARR3 bietet zudem ein gut handhabbares Modell, um arrestinabhängige Prozesse in der Biologie von Zilien/Außensegmenten und in der Signalübertragung sensorischer Neuronen zu analysieren.

Arrestin-C Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ARR3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Arrestin-C Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ARR3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ARR3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Arrestin-C-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ARR3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Arrestin-C-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Arrestin-C-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ARR3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.